Ni-TED琼脂糖纯化树脂

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产品介绍 新赛美 Ni-TED 琼脂糖纯化树脂是一种固定化金属离子亲和层析（IMAC）介质，专门用于纯化带有组氨酸标签（His-Tag）的重组蛋白。它 以高度交联的 6%琼脂糖凝胶为基质, 一种新型 IMAC 填料，螯合有非常牢固的 Ni 离子, 与传统的 Ni-NTA 相比，Ni-TED 树脂因对 Ni²⁺ 更强的螯合能力而展现出更出色的化学耐受性。 技术参数 纯化流程 缓冲液准备 所有缓冲液须用高纯水配制，使用前建议用 0.22 或 0.45 μm 滤膜过滤。 推荐使用的缓冲液配方： 缓冲液注意事项： 建议在含 0.5~1.0 M NaCl 的缓冲液中进行结合，中性至弱碱性 pH 7~8 条件效果最佳，常用磷酸钠缓冲液 也可使用 Tris-HCl 缓冲液，但在金属-蛋白质亲和力较弱时应避免使用，因其可能降低结合强度 样品准备 可溶性蛋白样品：细胞裂解后离心（12,000 rpm，4℃，20~30 分钟），上清用 0.22 或 0.45 μm 滤膜过滤后上样 包涵体蛋白样品：在所有缓冲液中加入 6 M 盐酸胍或 8 M 尿素 样品缓冲液应尽可能与平衡缓冲液一致 根据介质载量和料液中目标蛋白含量计算进料量 细胞裂解与样品澄清 裂解方法：常用方法包括超声破碎或高压匀浆。为防止蛋白降解，裂解缓冲液中建议加入适量的蛋白酶抑制剂。如果样品中核酸过多导致粘 稠，可加入 DNase I（终浓度 5 μg/ml）和 Mg 2+ （终浓度 1 mM），冰上孵育 10-15 分钟以降低粘度。 澄清处理（非常关键）：裂解后，必须彻底去除细胞碎片等不溶物，以防堵塞柱子。建议首先以 10,000-15,000×g 的离心力，在 4℃下离心 20-30 分钟，取上清。为确保效果，上清液最好再通过 0.45μm（或 0.22μm）的滤膜过滤 以下是使用预装柱进行纯化的一般步骤。 准备：将所有试剂恢复至室温。根据说明书建议的柱体积（CV）计算各缓冲液用量。 平衡：用 5-10 个柱体积的平衡缓冲液（不含或含低浓度咪唑，如 10mM）冲洗层析柱，直至流出液的 pH 和电导率与平衡液一致。 上样：将处理好的样品以适中流速（推荐 60-100 cm/h）加入层析柱，使目标蛋白与 Ni 2+ 充分结合。建议收集流穿液以备分析。 洗涤：上样后，用 10-15 个柱体积的洗涤缓冲液（平衡液中加入 10-40mM 咪唑）清洗柱子，去除非特异性结合的杂蛋白。 洗脱：用 5-10 个柱体积的洗脱缓冲液（平衡液中加入高浓度咪唑，如 250-500mM）将目标蛋白竞争下来。建议分段收集洗脱液（例如每 1 个柱 体积收集一管），以便后续通过 SDS-PAGE 等分析确定目标蛋白所在组分。 再生与保存 （1）去除强疏水结合的蛋白，脂蛋白和脂类 ： 使用 30%异丙醇清洗 5-10 个柱体积，接触时间为 15-20min 可以去除此类污染物。之后再用去离子水清洗 10 倍柱体积。也可以选择使用含有去 污剂的酸性或者碱性溶液清洗填料 2 倍柱体积。例如含有 0.1-0.5%非离子去污剂的 0.1M 醋酸溶液，接触时间为 1-2h。去污剂处理后，需用 70%的乙醇清洗 5 倍柱体积，彻底去除去污剂。最后利用去离子水清洗 10 倍柱体积。 （2）去除离子作用结合的蛋白： 使用 1.5MNaCl 溶液清洗 10-15min。再使用去离子水清洗 10 个柱体积，清洗好的柱子可再用 20%乙醇冲洗 2 个柱体积，置于 2-8℃保存。 常见问题与解决方案