Ni-NTA琼脂糖纯化树脂

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产品介绍 新赛美 Ni-NTA 琼脂糖凝胶（Ni-NTA Agarose）是一种预装了镍离子（Ni 2+ ）的亲和层析纯化介质。其基质为 6%的高度交联琼脂糖凝胶，通过化学方法偶联了四齿螯合剂 次氮基三乙酸（NTA） 作为配体。该配体能高效螯合 Ni 2+ 离子，形成非常稳定的八面体结构，可与 6×His 标签蛋白发生特性结合，从而实现目标蛋白的高效分离与纯化, NTA 配体含有四个螯合区，相比传统的三齿螯合剂（如 IDA），能与 Ni 2+ 结合得更牢固，有效防止纯化过程中金属离子的脱落。 技术参数 各试剂与 Ni-NTA 纯化树脂兼容性 纯化流程 缓冲液准备 所有缓冲液须用高纯水配制，使用前建议用 0.22 或 0.45 μm 滤膜过滤。 推荐使用的缓冲液配方： 缓冲液注意事项： 建议在含 0.5~1.0 M NaCl 的缓冲液中进行结合，中性至弱碱性 pH 7~8 条件效果最佳，常用磷酸钠缓冲液 也可使用 Tris-HCl 缓冲液，但在金属-蛋白质亲和力较弱时应避免使用，因其可能降低结合强度 样品准备 可溶性蛋白样品：细胞裂解后离心（12,000 rpm，4℃，20~30 分钟），上清用 0.22 或 0.45 μm 滤膜过滤后上样 包涵体蛋白样品：在所有缓冲液中加入 6 M 盐酸胍或 8 M 尿素 样品缓冲液应尽可能与平衡缓冲液一致 根据介质载量和料液中目标蛋白含量计算进料量 细胞裂解与样品澄清 裂解方法：常用方法包括超声破碎或高压匀浆。为防止蛋白降解，裂解缓冲液中建议加入适量的蛋白酶抑制剂。如果样品中核酸过多导致粘稠，可加入 DNase I（终浓度 5 μg/ml）和 Mg 2+ （终浓度 1 mM），冰上孵育 10-15 分钟以降低粘度。 澄清处理（非常关键）：裂解后，必须彻底去除细胞碎片等不溶物，以防堵塞柱子。建议首先以 10,000-15,000×g 的离心力，在 4℃下离心 20-30 分钟，取上清。为确保效果，上清液最好再通过 0.45μm（或 0.22μm）的滤膜过滤 以下是使用预装柱进行纯化的一般步骤。 准备：将所有试剂恢复至室温。根据说明书建议的柱体积（CV）计算各缓冲液用量。 平衡：用 5-10 个柱体积的平衡缓冲液（不含或含低浓度咪唑，如 10mM）冲洗层析柱，直至流出液的 pH 和电导率与平衡液一致。 上样：将处理好的样品以适中流速（推荐 60-100 cm/h）加入层析柱，使目标蛋白与 Ni 2+ 充分结合。建议收集流穿液以备分析。 洗涤：上样后，用 10-15 个柱体积的洗涤缓冲液（平衡液中加入 10-40mM 咪唑）清洗柱子，去除非特异性结合的杂蛋白。 洗脱：用 5-10 个柱体积的洗脱缓冲液（平衡液中加入高浓度咪唑，如 250-500mM）将目标蛋白竞争下来。建议分段收集洗脱液（例如每 1 个柱 体积收集一管），以便后续通过 SDS-PAGE 等分析确定目标蛋白所在组分。 再生与保存 当以下情况出现时，建议进行彻底再生： 结合能力显著下降 镍离子渗漏明显 非特异性吸附增加 再生操作 （1）从层析柱下端流干所有溶液 （2）用 2 倍柱体积的 0.2 M Acetic Acid / 6 M Guanidine HCl 洗涤 （3）用 2 倍柱体积的去离子水 洗 （4）用 3 倍柱体积的 2% SDS 洗涤 （5）依次用 1 倍柱体积 50%、5 倍柱体积的 100%乙醇进行梯度洗涤 （6）再依次用 1 倍柱体积 的 25%乙醇洗涤 （7）用 1 倍柱体积的去离子水洗涤 （8）用 5 倍柱体积的 0.1 M EDTA（pH 8.0） 洗涤 （9）用 3 倍柱体积的去离子水洗 （10）用 5 倍柱体积的 100 mM NiSO 4 ·6H₂ O（或 100 mM NiCl 2 ）洗涤 （11）用 10 倍柱体积的平衡缓冲液,洗去游离镍离子，柱子即可再次使用 （12）如需长期保存，再生后加入 1 倍柱体积的 20%乙醇，封住上下端口，在 4℃ 保存。下次使用前需重新执行挂镍步骤。 快速再生法 （1）适用于常规清洁（无镍离子去除） （2）每次纯化完成后，建议执行以下快速清洗： （3）用 0.5 M 咪唑缓冲液 洗涤 5 个柱体积 （4）用 去离子水 洗涤 5 个柱体积 （5）用 1-2 M NaCl 溶液 洗涤 5 个柱体积 （6）用 去离子水 洗涤 5 个柱体积 常见问题与解决方案