细胞核蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒

02NC00023

产品介绍 细胞研究常需分离不同细胞组分，其中细胞核、细胞浆蛋白检测应用最为广泛。本核浆蛋白抽提试剂盒操作简便，可从培养细胞或新鲜 组织中分步提取胞浆蛋白与核蛋白。 本试剂盒采用低渗裂解策略：细胞在胞蛋白提取试剂 A、B 作用下细胞膨胀、细胞膜破裂，释放胞浆蛋 白；离心收集细胞核沉淀后，通过高盐核蛋白提取试剂洗脱核蛋白。提取产物适用于蛋白免疫印迹、免疫沉淀等各类后续蛋白实验。 操作步骤 1、 将融化后的浆蛋白提取试剂 A 和核蛋白提取试剂放置于冰上，按样本量分别取出浆蛋白提取试剂 A 和核蛋白提取试剂，按 体积比添加至 1X 蛋白酶抑制剂（推荐货号：P001）。 2、 A.对于 贴壁细胞 ：4℃，500g 离心 5min 以沉淀细胞。用预冷的 PBS 洗涤两遍弃干净上清。 B.对于 悬浮细胞 ：使用 PBS 漂洗细胞 1 次，离心收集细胞，尽可能吸除全部上清，保留细胞沉淀备用。。 C.对于 新鲜组织 ： a).将组织尽可能切成非常细小的碎片。按照 20:1 的比例混合适当量的浆蛋白抽提试剂 A 和 B(例如 200ul 浆蛋白抽 提试剂 A 中加入 10u 浆蛋白抽提试剂 B)（ 确认已添加蛋白酶抑制剂 ）。按照每 60mg 组织加入 200ul 组织匀浆液的比 例混合组织和组织匀浆液(对于不超过 30mg 的组织样品，仅需加入 100ul 组织匀浆液)，并在玻璃匀浆器内充分匀浆。 匀浆需在冰浴或 4℃进行。 b). 匀浆后把匀浆液转移到塑料离心管内，冰浴放置 15min。 c). 4℃, 1500g 离心 5min。把上清转移至一预冷的塑料管中，是抽提得到的部分细胞浆蛋白。 (吸上清时千万不要触及沉淀。) d). 对于沉淀，到了这一步已经充分匀浆，但很多细胞还没有破碎。接下去按照使用说明的步骤 3-12 步骤开始操作 ， （即把沉淀当做已经离心收集好的细胞沉淀操作，继续提取得到细胞浆蛋白和核蛋白） 。 3、 每 20ul 细胞沉淀加入 200ul 细胞浆蛋白抽提试剂 A(已添加蛋白酶抑制剂）。(例如对于二百万 HeLa 细胞，其细胞沉 淀的体积大约为 20ul 或 40mg。) 4、 最高速剧烈涡旋 5-10s，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。(如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开，可以适当延长涡旋 时间。) 5、冰浴 10-15min。 6、加入细胞浆蛋白抽提试剂 B 10ul。最高速涡旋 5-10s，冰浴 1min。 7、最高速涡旋 5-10s，4℃ 12,000-16,000g 离心 5min。 8、立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白。可以立即使用，也可以冻存- 70℃保存备用 。(千万不 要触及沉淀，可以在沉淀上方保留极小体积的上清，以免触及沉淀。) 9、对于沉淀，完全吸尽残余的上清，加入 50ul 细胞核蛋白抽提试剂(已添加蛋白酶抑制剂）。 10、最高速涡旋 15-30s，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。然后放回冰浴中，每隔 1-2min 再高速涡旋 15-30s，共 30min。 11、4℃ ,12,000-16,000g 离心 10min。 12、立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞核蛋白。可以立即使用，也可以冻存- 70℃保存备用 。 保存条件 -20℃保存，冰袋运输，保质期12个月； 注意事项 1. 需取新鲜样本制备以及建议低温下实验操作。 2. 蛋白提取试剂的用量可根据细胞量等比例扩大。 3. 制备样品前，浆蛋白提取试剂 A 和核蛋白提取试剂都需加入蛋白酶抑制剂（推荐货号：P001）。用于 磷酸化抗体的可选择蛋白酶加磷酸酶抑制剂混合物（推荐货号：P002）。 4. 本试剂盒为低温运输，使用前需室温或水浴（低于 30℃）融化，不可加热融化。 5. 本产品仅限科研使用。